4月26日，國家衛健委舉辦全國視頻會(huì )議，明確提出“所有縣區級以上疾控機構、二級以上綜合醫院要抓緊進(jìn)行改造，在短時(shí)間內形成核酸檢測能力”。

各地的公立機構檢測能力不能滿(mǎn)足需求只是暫時(shí)的，獨立醫學(xué)實(shí)驗室在充實(shí)檢測力量的同時(shí)，發(fā)揮自己豐富的檢驗管理運營(yíng)理念，以及區域化覆蓋的經(jīng)驗優(yōu)勢，融入到“國家隊”核酸檢測能力的建設中，順勢而為，乘勢而上。

隨著(zhù)各地都在建立PCR實(shí)驗室，本文從硬件基礎的角度，梳理了PCR實(shí)驗室建設的幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，獨立醫學(xué)實(shí)驗室可以運用豐富的運營(yíng)經(jīng)驗，進(jìn)行建設指導、人員梯隊建立、質(zhì)控體系搭建、區域化服務(wù)支持等。

如何建設PCR實(shí)驗室

與PCR實(shí)驗室建設相關(guān)的指導文件主要有四份：

要求臨床PCR實(shí)驗室，不但在實(shí)驗室設置及儀器設備等硬件上要滿(mǎn)足開(kāi)展臨床檢驗的條件，而且要求實(shí)驗室在日常工作要有文件化的工作程序。

下面就在PCR實(shí)驗室建設過(guò)程中的幾個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)進(jìn)行闡述:

根據實(shí)驗室的具體情況編寫(xiě)質(zhì)量體系文件，《質(zhì)量手冊》、《程序文件》、《作業(yè)指導書(shū)》，并保證管理體系運行有效。

管理體系的特點(diǎn)是應有明確的目的、規范的管理、有效的制約、高效的機制、能自我發(fā)展的整體。

建立完善的SOP文件，對完成各項質(zhì)量活動(dòng)的方法作出規定，每個(gè)SOP都應對一個(gè)或一組相互關(guān)系的活動(dòng)進(jìn)行描述。

每個(gè)SOP文件應說(shuō)明該項質(zhì)量各環(huán)節的輸入、轉換和輸出所需的文件、物資、人員、記錄以及它們與有關(guān)活動(dòng)的接口關(guān)系。

明確每個(gè)環(huán)節轉換過(guò)程中各項因素的要求，即由誰(shuí)做、做什么、做到什么程序、達到什么要求，如何控制、形成什么記錄和報告，以及相應的審批手續。

規定在質(zhì)量活動(dòng)中需要注意的例外或特殊情況的糾正措施。SOP應簡(jiǎn)練、明確和易懂并且工作人員熟練掌握和嚴格遵守。

要完成一組PCR實(shí)驗，通常需要經(jīng)過(guò)試劑配制、樣品處理、核酸擴增和產(chǎn)物分析4個(gè)實(shí)驗過(guò)程。

這4個(gè)實(shí)驗過(guò)程的實(shí)驗用房應相鄰布置，組成一個(gè)獨立的PCR實(shí)驗區。標準的PCR實(shí)驗區包括:試劑準備區、標本制備區、擴增區、產(chǎn)物分析區、各區配套的緩沖區及公共走廊。

某醫院PCR實(shí)驗室平面布局如圖1所示，整個(gè)區域有一個(gè)公用走廊，每個(gè)獨立實(shí)驗區設有專(zhuān)門(mén)的緩沖區。通過(guò)壓差控制，使整個(gè)PCR實(shí)驗過(guò)程中試劑和標本免受氣溶膠的污染，并且降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。

圖表1、某醫院PCR實(shí)驗室平面圖

該實(shí)驗區主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。

試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區，不得經(jīng)過(guò)其他區域。試劑原材料必須貯存在本區內，并在本區內制備成所需的貯存試劑。

試劑準備區配備有2~8°C冰箱和-80°C冰箱，計算冷負荷時(shí)，需要將它們計算在內。

房間的面積宜控制在15m2~20m2。本區的壓力梯度要求為:相對正壓狀態(tài)，以防止外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染。

該區域主要進(jìn)行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時(shí)cDNA的合成。

標本制備區配備有2~8°C冰箱和-20°C冰箱，計算冷負荷時(shí)，需要將它們計算在內。在標本制備區，還需要配備生物安全柜，用于進(jìn)行提取核酸的操作。

為避免提取的核酸在柜內反復循環(huán)，造成標本之間的交叉污染，出現假陽(yáng)性結果，該區域配備的生物安全柜必須是B2型的。生物安全柜工作區垂直氣流全部來(lái)自實(shí)驗室，排風(fēng)經(jīng)過(guò)高效過(guò)濾器(www.rfilter.com)過(guò)濾后直接排至室外，不允許回到安全柜和實(shí)驗室中。

根據經(jīng)驗，如果實(shí)驗室內配備生物安全柜，每配備一臺，實(shí)驗室的面積增加10m2;標本制備區的面積宜在25m2~30m2之間。本區的壓力梯度要求為:相對于鄰近區域為正壓，以避免從鄰近區進(jìn)入本區的氣溶膠污染。

該區域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來(lái)自樣本制備區)的加入和主反應混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區)制備成反應混合液等也可在本區內進(jìn)行。

在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開(kāi)反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區內進(jìn)行。

擴增室主要配備PCR實(shí)驗室的核心儀器PCR儀，本文實(shí)例中使用了ABI7500和ABI9700兩種PCR儀。

在實(shí)驗室建造過(guò)程中，需要給PCR儀配備專(zhuān)門(mén)的UPS電源，以保證其正常工作。該區面積控制在15m2~20m2。

本區的壓力梯度要求為:相對于鄰近區域為負壓，以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區內的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應在超凈臺內進(jìn)行。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實(shí)現。

該區域主要進(jìn)行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測，此區域可不設。

在室內配備通風(fēng)櫥，保證房間內的相對負壓，空氣從室外流向室內。該區面積控制在15m2~20m2。

本區是最主要的擴增產(chǎn)物污染來(lái)源，因此對本區的壓力梯度的要求為:相對于鄰近區域為負壓，以避免擴增產(chǎn)物從本區擴散至其它區域。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實(shí)現。

根據壓力梯度的要求，試劑配制室和樣品處理室為相對正壓，擴增室和產(chǎn)物分析室為相對負壓，要求正壓的區域和要求負壓的區域的緩沖室內的壓力設計大不相同。

正壓緩沖室符合一般正壓潔凈室的緩沖原則，主要是防止室外環(huán)境空氣中的氣溶膠進(jìn)入室內。正壓緩沖室的布置如圖2所示。

圖表2、正壓緩沖室的布置圖

負壓緩沖室則是要求緩沖室對核酸擴增室及產(chǎn)物分析區保持正壓，對緩沖室外也保持正壓(主要是滿(mǎn)足室內凈化需要，如室內無(wú)潔凈要求，此處可以為0壓)。負壓緩沖室的布置如圖3所示。

圖表3、負壓緩沖室的布置圖

PCR實(shí)驗室設計的核心問(wèn)題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見(jiàn)的有以下幾種污染類(lèi)型:擴增產(chǎn)物的污染;天然基因組DNA的污染;試劑的污染以及標本間的污染。因此要避免污染，首先應是預防，而不是排除。